Traucējumu faktori PCR reakcijās

PCR reakcijas laikā bieži rodas daži traucējoši faktori.
Sakarā ar ļoti augsto PCR jutīgumu, piesārņojums tiek uzskatīts par vienu no vissvarīgākajiem faktoriem, kas ietekmē PCR rezultātus, un tas var radīt nepatiesus pozitīvus rezultātus.
Tikpat kritiski ir dažādi avoti, kas noved pie kļūdaini negatīviem rezultātiem. Ja viena vai vairākas būtiskas PCR maisījuma daļas vai pati pastiprināšanas reakcija tiek kavēta vai traucēta, diagnostikas testu var kavēt. Tas var izraisīt samazinātu efektivitāti un pat nepatiesus negatīvus rezultātus.
Papildus inhibīcijai pirms parauga sagatavošanas var rasties mērķa nukleīnskābju integritāte nosūtīšanas un/vai uzglabāšanas apstākļu dēļ. Jo īpaši augsta temperatūra vai nepietiekama uzglabāšana var izraisīt šūnu un nukleīnskābju bojājumus. Šūnu un audu fiksācija un parafīna iegulšana ir labi zināmi DNS sadrumstalotības cēloņi un pastāvīga problēma (sk. 1. un 2. attēlu). Šajos gadījumos pat optimāla izolācija un attīrīšana nepalīdzēs.

1. attēls | Imobilizācijas ietekme uz DNS integritāti
Agarozes gēla elektroforēze parādīja, ka DNS kvalitāte, kas izolēta no autopsiju parafīna sekcijām, ievērojami atšķīrās. Atkarībā no fiksācijas metodes ekstraktos bija dažādu vidējā fragmenta garuma DNS. DNS tika saglabāts tikai tad, kad fiksēts vietējos saldētos paraugos un buferētā neitrālā formalīnā. Spēcīgi skāba bouīna fiksējoša vai nesaskaņota, skābes skābes saturoša formalīna izmantošana izraisīja ievērojamu DNS zudumu. Atlikušā frakcija ir ļoti sadrumstalota.
Kreisajā pusē fragmentu garums tiek izteikts kilobāzes pāros (KBP)

2. attēls | Nukleīnskābju mērķu integritātes zaudēšana
(A) A 3′-5 ′ sprauga abās virzienos izraisīs mērķa DNS pārtraukumu. DNS sintēze joprojām notiks uz mazā fragmenta. Tomēr, ja DNS fragmentā trūkst grunts atkvēlināšanas vietas, notiek tikai lineāra pastiprināšana. Visbalstīgākajā gadījumā fragmenti var atsestēt viens uz otru, bet raža būs maza un zem noteikšanas līmeņa.
(b) Bāzu zudums, galvenokārt attīrīšanas un timidīna dimēra veidošanās dēļ, noved pie H-saites skaita samazināšanās un TM samazināšanās. Iegarenā sasilšanas fāzes laikā grunti izkusīs no matricas DNS un neradīs rūdīšanu pat mazāk stingros apstākļos.
c) blakus esošās timīna bāzes veido TT dimēru.
Vēl viena izplatīta problēma, kas bieži rodas molekulārā diagnostikā, ir mērķa nukleīnskābju mazāka nekā optimāla izdalīšanās, salīdzinot ar fenola-hloroforma ekstrakciju. Ārkārtējos gadījumos to var saistīt ar viltus negatīviem. Daudz laika var ietaupīt, vārot līzi vai fermentatīvu šūnu atlieku gremošanu, taču šī metode bieži rada zemu PCR jutīgumu nepietiekamas nukleīnskābes izdalīšanās dēļ.

Polimerāzes aktivitātes kavēšana pastiprināšanas laikā

Kopumā inhibīcija tiek izmantota kā konteinera koncepcija, lai aprakstītu visus faktorus, kas noved pie suboptimāliem PCR rezultātiem. Stingrā bioķīmiskajā nozīmē inhibīcija ir ierobežota ar enzīma aktivitāti, ti, tā samazina vai novērš substrāta produktu pārveidošanu, mijiedarbojoties ar DNS polimerāzes vai tā kofaktora aktīvo vietu (piemēram, mg2+ TAQ DNS polimerāzei).
Komponenti paraugā vai dažādos buferos un ekstraktos, kas satur reaģentus, var tieši kavēt fermentu vai notvert tā kofaktorus (piemēram, EDTA), tādējādi inaktivējot polimerāzi un, savukārt, izraisa samazinātus vai nepatiesus negatīvus PCR rezultātus.
Tomēr daudzas mijiedarbības starp reakcijas komponentiem un mērķi saturošām nukleīnskābēm tiek apzīmētas arī kā “PCR inhibitori”. Kad šūnas integritāti izjauc izolācija un izdalās nukleīnskābe, var rasties mijiedarbība starp paraugu un tā apkārtējo šķīdumu un cieto fāzi. Piemēram, “Scavengers” var saistīt vienas vai divpavedienu DNS, izmantojot nekonvalentas mijiedarbības, un traucēt izolāciju un attīrīšanu, samazinot mērķu skaitu, kas galu galā sasniedz PCR reakcijas trauku.
Kopumā PCR inhibitori ir sastopami lielākajā daļā ķermeņa šķidrumu un reaģentu, ko izmanto klīniskajiem diagnostiskajiem testiem (urīnviela urīnā, hemoglobīnā un heparīnā asinīs), uztura bagātinātājiem (organiskajiem komponentiem, glikogēnam, taukiem, Ca2+ joniem) un komponentiem vidē (fenoli, smagie metāli))

Izplatītākus PCR inhibitorus var atrast baktērijās un eikariotu šūnās, nemērķa DNS, DNS saistošajās audu matricu makromolekulās un laboratorijas aprīkojumā, piemēram, cimdos un plastmasā. Nukleīnskābju attīrīšana ekstrakcijas laikā vai pēc tās ir vēlamā metode PCR inhibitoru noņemšanai.
Mūsdienās dažādi automatizēti ekstrakcijas aprīkojums var aizstāt daudzus manuālus protokolus, bet 100% mērķu atgūšana un/vai attīrīšana nekad nav sasniegta. Potenciālie inhibitori joprojām var būt attīrītās nukleīnskābēs vai arī jau ir spēkā. Pastāv dažādas stratēģijas, lai samazinātu inhibitoru ietekmi. Atbilstošās polimerāzes izvēlei var būt būtiska ietekme uz inhibitoru aktivitāti. Citas pārbaudītas PCR inhibīcijas samazināšanas metodes ir palielināta polimerāzes koncentrācija vai piedevu piemērošana, piemēram, BSA.
PCR reakciju kavēšanu var pierādīt, izmantojot iekšējo procesa kvalitātes kontroli (IPC).
Jāuzmanās, lai noņemtu visus ekstrakcijas komplektā esošos reaģentus un citus risinājumus, piemēram, etanolu, EDTA, CETAB, LICL, Guscn, SDS, izopropanolu un fenolu, no nukleīnskābes izolāta ar rūpīgu mazgāšanas pakāpi. Atkarībā no to koncentrācijas tie var aktivizēt vai kavēt PCR.