Interferences faktori PCR reakcijās

PCR reakcijas laikā bieži rodas daži traucējoši faktori.
PCR ļoti augstās jutības dēļ piesārņojums tiek uzskatīts par vienu no svarīgākajiem faktoriem, kas ietekmē PCR rezultātus, un tas var radīt viltus pozitīvus rezultātus.
Tikpat svarīgi ir dažādie avoti, kas noved pie viltus negatīviem rezultātiem. Ja viena vai vairākas būtiskas PCR maisījuma vai pašas amplifikācijas reakcijas daļas tiek kavētas vai traucētas, diagnostiskā analīze var tikt kavēta. Tas var izraisīt samazinātu efektivitāti un pat viltus negatīvus rezultātus.
Papildus inhibīcijai mērķa nukleīnskābju integritātes zudums var rasties transportēšanas un/vai uzglabāšanas apstākļu dēļ pirms parauga sagatavošanas. Jo īpaši augsta temperatūra vai nepietiekama uzglabāšana var izraisīt šūnu un nukleīnskābju bojājumus. Šūnu un audu fiksācija un iestrādāšana parafīnā ir labi zināmi DNS fragmentācijas cēloņi un pastāvīga problēma (sk. 1. un 2. attēlu). Šādos gadījumos pat optimāla izolācija un attīrīšana nepalīdzēs.

1. attēls | Imobilizācijas ietekme uz DNS integritāti
Agarozes gela elektroforēze parādīja, ka no autopsiju parafīna griezumiem izolētās DNS kvalitāte ievērojami atšķīrās. Ekstraktos bija dažāda vidējā fragmentu garuma DNS atkarībā no fiksācijas metodes. DNS saglabājās tikai tad, ja tā tika fiksēta dabiskos saldētos paraugos un buferētā neitrālā formalīnā. Stipri skāba Buēna fiksatora vai nebuferēta, skudrskābi saturoša formalīna izmantošana izraisīja ievērojamu DNS zudumu. Atlikušā frakcija ir ļoti fragmentēta.
Kreisajā pusē fragmentu garums ir izteikts kilobāzu pāros (kbp).

2. attēls | Nukleīnskābju mērķu integritātes zudums
(a) 3′-5′ sprauga abās virknēs izraisīs mērķa DNS pārrāvumu. DNS sintēze mazajā fragmentā joprojām notiks. Tomēr, ja DNS fragmentā trūkst praimera piejaukšanās vietas, notiek tikai lineāra amplifikācija. Visizdevīgākajā gadījumā fragmenti var atkārtoti piesātināt viens otru, bet iznākums būs mazs un zem noteikšanas līmeņa.
(b) Bāzu zudums, galvenokārt depurinācijas un timidīna dimēru veidošanās dēļ, noved pie H saišu skaita samazināšanās un Tm samazināšanās. Pagarinātās sasilšanas fāzes laikā primeri atdalīsies no matricas DNS un nesavienosies pat mazāk stingros apstākļos.
(c) Blakus esošās timīna bāzes veido TT dimēru.
Vēl viena izplatīta problēma, kas bieži rodas molekulārajā diagnostikā, ir mazāk optimāla mērķa nukleīnskābju izdalīšanās, salīdzinot ar fenola-hloroforma ekstrakciju. Ekstrēmos gadījumos tas var būt saistīts ar viltus negatīviem rezultātiem. Daudz laika var ietaupīt, vārot līzi vai fermentatīvi sagremojot šūnu atliekas, taču šī metode bieži vien rada zemu PCR jutību nepietiekamas nukleīnskābju izdalīšanās dēļ.

Polimerāzes aktivitātes inhibīcija amplifikācijas laikā

Vispārīgi runājot, inhibīcija tiek izmantota kā konteinera jēdziens, lai aprakstītu visus faktorus, kas noved pie suboptimāliem PCR rezultātiem. Stingri bioķīmiskā nozīmē inhibīcija aprobežojas ar enzīma aktivitāti, t.i., tā samazina vai novērš substrāta-produkta konversiju, mijiedarbojoties ar DNS polimerāzes vai tās kofaktora aktīvo centru (piemēram, Mg2+ Taq DNS polimerāzes gadījumā).
Parauga komponenti vai dažādi buferi un ekstrakti, kas satur reaģentus, var tieši inhibēt enzīmu vai piesaistīt tā kofaktorus (piemēram, EDTA), tādējādi inaktivējot polimerāzi un savukārt izraisot samazinātus vai kļūdaini negatīvus PCR rezultātus.
Tomēr daudzas mijiedarbības starp reakcijas komponentiem un mērķi saturošām nukleīnskābēm tiek apzīmētas arī kā "PCR inhibitori". Kad šūnas integritāte ir izjaukta izolācijas rezultātā un nukleīnskābe ir atbrīvota, var notikt mijiedarbība starp paraugu un tā apkārtējo šķīdumu un cieto fāzi. Piemēram, "ķerēji" var saistīties ar vienpavedienu vai divpavedienu DNS, izmantojot nekovalentas mijiedarbības, un traucēt izolāciju un attīrīšanu, samazinot mērķu skaitu, kas galu galā sasniedz PCR reakcijas trauku.
Kopumā PCR inhibitori ir sastopami lielākajā daļā ķermeņa šķidrumu un reaģentu, ko izmanto klīniskajos diagnostikas testos (urīnviela urīnā, hemoglobīns un heparīns asinīs), uztura bagātinātājos (organiskās sastāvdaļas, glikogēns, tauki, Ca2+ joni) un vides sastāvdaļās (fenoli, smagie metāli).

Biežāk sastopamie PCR inhibitori ir atrodami baktērijās un eikariotu šūnās, ne-mērķa DNS, DNS saistošās audu matricu makromolekulās un laboratorijas aprīkojumā, piemēram, cimdos un plastmasā. Nukleīnskābju attīrīšana ekstrakcijas laikā vai pēc tās ir vēlamā metode PCR inhibitoru noņemšanai.
Mūsdienās dažādas automatizētas ekstrakcijas iekārtas var aizstāt daudzus manuālos protokolus, taču 100% mērķu atgūšana un/vai attīrīšana nekad nav panākta. Potenciālie inhibitori joprojām var būt attīrītajās nukleīnskābēs vai arī tie jau var būt iedarbojušies. Pastāv dažādas stratēģijas, lai samazinātu inhibitoru ietekmi. Piemērotas polimerāzes izvēle var būtiski ietekmēt inhibitoru aktivitāti. Citas pārbaudītas metodes PCR inhibīcijas samazināšanai ir polimerāzes koncentrācijas palielināšana vai piedevu, piemēram, BSA, lietošana.
PCR reakciju inhibīciju var pierādīt, izmantojot iekšējo procesa kvalitātes kontroli (IPC).
Jāuzmanās, lai no nukleīnskābju izolāta, rūpīgi mazgājot, tiktu atdalīti visi reaģenti un citi šķīdumi ekstrakcijas komplektā, piemēram, etanols, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanols un fenols. Atkarībā no to koncentrācijas tie var aktivizēt vai inhibēt PCR.