Interferences faktori PCR reakcijās

PCR reakcijas laikā bieži rodas daži traucējoši faktori.
Tā kā PCR ir ļoti jutīga, piesārņojums tiek uzskatīts par vienu no svarīgākajiem faktoriem, kas ietekmē PCR rezultātus, un tas var radīt kļūdaini pozitīvus rezultātus.
Tikpat svarīgi ir dažādi avoti, kas rada kļūdaini negatīvus rezultātus. Ja viena vai vairākas būtiskas PCR maisījuma daļas vai pati amplifikācijas reakcija tiek kavēta vai traucēta, diagnostikas tests var tikt kavēts. Tas var samazināt efektivitāti un pat viltus negatīvus rezultātus.
Papildus inhibīcijai var rasties mērķa nukleīnskābes integritātes zudums transportēšanas un/vai uzglabāšanas apstākļu dēļ pirms parauga sagatavošanas. Jo īpaši augsta temperatūra vai neatbilstoša uzglabāšana var izraisīt šūnu un nukleīnskābju bojājumus. Šūnu un audu fiksācija un parafīna iegulšana ir labi zināmi DNS fragmentācijas cēloņi un pastāvīga problēma (sk. 1. un 2. attēlu). Šajos gadījumos pat optimāla izolācija un attīrīšana nepalīdzēs.

1. attēls | Imobilizācijas ietekme uz DNS integritāti
Agarozes gēla elektroforēze parādīja, ka no autopsijas parafīna sekcijām izolētās DNS kvalitāte ievērojami atšķiras. Atkarībā no fiksācijas metodes ekstraktos bija dažādu vidējo fragmentu garumu DNS. DNS tika saglabāta tikai tad, kad tā tika fiksēta vietējos saldētos paraugos un buferētā neitrālā formalīnā. Spēcīgi skāba Bouin fiksatora vai nebuferēta, skudrskābi saturoša formalīna izmantošana izraisīja ievērojamu DNS zudumu. Atlikusī frakcija ir ļoti sadrumstalota.
Kreisajā pusē fragmentu garums ir izteikts kilobāzes pāros (kbp)

2. attēls | Nukleīnskābju mērķu integritātes zudums
a) 3′-5′ sprauga abās virknēs izraisīs mērķa DNS pārtraukumu. DNS sintēze joprojām notiks mazajā fragmentā. Tomēr, ja DNS fragmentā trūkst primera atkausēšanas vietas, notiek tikai lineāra amplifikācija. Vislabvēlīgākajā gadījumā fragmenti var atkārtoti piesātināt viens otru, bet raža būs neliela un zem noteikšanas līmeņa.
(b) Bāžu zudums, galvenokārt depurinācijas un timidīna dimēra veidošanās dēļ, samazina H-saišu skaitu un samazina Tm. Pagarinātās sasilšanas fāzes laikā primeri izkusīs no matricas DNS un netiks atšķaidīti pat mazāk stingros apstākļos.
(c) Blakus esošās timīna bāzes veido TT dimēru.
Vēl viena izplatīta problēma, kas bieži rodas molekulārajā diagnostikā, ir mazāk nekā optimāla mērķa nukleīnskābju izdalīšanās salīdzinājumā ar fenola-hloroforma ekstrakciju. Ārkārtējos gadījumos to var saistīt ar viltus negatīviem rezultātiem. Daudz laika var ietaupīt ar viršanas līzi vai šūnu atlieku enzīmu gremošanu, taču šī metode bieži izraisa zemu PCR jutību nepietiekamas nukleīnskābju izdalīšanās dēļ.

Polimerāzes aktivitātes kavēšana amplifikācijas laikā

Parasti inhibīcija tiek izmantota kā konteinera jēdziens, lai aprakstītu visus faktorus, kas rada suboptimālus PCR rezultātus. Stingri bioķīmiskā nozīmē inhibīcija aprobežojas ar enzīma aktivitāti, ti, tā samazina vai novērš substrāta-produkta konversiju, mijiedarbojoties ar DNS polimerāzes vai tās kofaktora aktīvo vietu (piemēram, Mg2+ Taq DNS polimerāzei).
Komponenti paraugā vai dažādi buferi un ekstrakti, kas satur reaģentus, var tieši inhibēt fermentu vai aizturēt tā kofaktorus (piemēram, EDTA), tādējādi inaktivējot polimerāzi un, savukārt, izraisot samazinātus vai kļūdaini negatīvus PCR rezultātus.
Tomēr daudzas mijiedarbības starp reakcijas komponentiem un mērķa saturošām nukleīnskābēm tiek apzīmētas arī kā “PCR inhibitori”. Kad šūnas integritāte ir izjaukta ar izolāciju un nukleīnskābe ir atbrīvota, var rasties mijiedarbība starp paraugu un tā apkārtējo šķīdumu un cieto fāzi. Piemēram, “savācēji” var saistīt vienas vai divpavedienu DNS, izmantojot nekovalentu mijiedarbību, un traucēt izolāciju un attīrīšanu, samazinot to mērķu skaitu, kas galu galā sasniedz PCR reakcijas trauku.
Parasti PCR inhibitori atrodas lielākajā daļā ķermeņa šķidrumu un reaģentu, ko izmanto klīniskās diagnostikas pārbaudēs (urīnviela urīnā, hemoglobīns un heparīns asinīs), uztura bagātinātājos (organiskie komponenti, glikogēns, tauki, Ca2+ joni) un vides komponenti (fenoli). , smagie metāli)

Izplatītākus PCR inhibitorus var atrast baktērijās un eikariotu šūnās, nemērķa DNS, DNS saistošās audu matricu makromolekulās un laboratorijas iekārtās, piemēram, cimdos un plastmasā. Nukleīnskābju attīrīšana ekstrakcijas laikā vai pēc tās ir vēlamā metode PCR inhibitoru noņemšanai.
Mūsdienās dažādas automatizētas ekstrakcijas iekārtas var aizstāt daudzus manuālos protokolus, taču 100% atgūšana un/vai mērķu attīrīšana nekad nav sasniegta. Potenciālie inhibitori joprojām var būt attīrītajās nukleīnskābēs vai jau ir stājušies spēkā. Pastāv dažādas stratēģijas, lai samazinātu inhibitoru ietekmi. Piemērotas polimerāzes izvēle var būtiski ietekmēt inhibitoru aktivitāti. Citas pārbaudītas metodes PCR inhibīcijas samazināšanai ir polimerāzes koncentrācijas palielināšana vai piedevu, piemēram, BSA, lietošana.
PCR reakciju kavēšanu var pierādīt, izmantojot iekšējo procesa kvalitātes kontroli (IPC).
Jāuzmanās, lai no nukleīnskābes izolāta rūpīgi mazgātu visus reaģentus un citus ekstrakcijas komplektā esošos šķīdumus, piemēram, etanolu, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolu un fenolu. Atkarībā no koncentrācijas tie var aktivizēt vai inhibēt PCR.